甲氧芐氨嘧啶檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用競爭ELISA方法檢測組織、飼料、尿樣和血清等樣品中的甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP），試劑盒由預(yù)包被甲氧芐氨嘧啶抗體的酶標(biāo)板、TMP酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的甲氧芐氨嘧啶和TMP酶標(biāo)記物競爭酶標(biāo)板上預(yù)包被的甲氧芐氨嘧啶抗體，用TMB底物顯色后，樣本吸光度值與樣本甲氧芐氨嘧啶含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中甲氧芐氨嘧啶的殘留量。
2 甲氧芐氨嘧啶檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.015ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
飼料……………………………………0.8ppb
組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………0.2ppb
血清/尿液/血漿………………………0.2ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
甲氧芐氨嘧啶…………………………100%
磺胺吡啶……………………………<0.1%
磺胺…………………………………<0.1%
磺胺嘧啶……………………………<0.1%
磺胺異噁唑…………………………<0.1%
磺胺噻唑……………………………<0.1%
磺胺甲基嘧啶………………………<0.1%
磺胺多辛……………………………<0.1%
 2.5 樣本回收率：
飼料……………………85%±10%
組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………85±15%
血清/尿液/血漿………………………85±10%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.015ppb、0.045ppb、0.135ppb、0.405ppb、1.215ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb…………………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
2×復(fù)溶液………………………50ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書…………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：無水甲醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鈉
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1×復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋。
配液2：0.1M鹽酸
    取濃鹽酸10ml加入到1200ml離子水中。
配液3：1M氫氧化鈉
    取氫氧化鈉4g加入到100ml離子水中。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 飼料處理方法 
1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加20ml 0.1M鹽酸，振蕩15分鐘，室溫3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取1ml上清到1.5ml離心管，加入55ul 1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到6-8，混勻（針對不同的飼料樣品可以調(diào)節(jié)1M氫氧化鈉的用量），室溫3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
3）取0.5ml上清到另一1.5ml離心管，加入0.5ml的1×復(fù)溶液，混勻；
3）取50μl進(jìn)行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：0.8ppb
5.3.2 組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）處理方法 
1）取除去脂肪的勻漿組織2g于50ml離心管中，加入6 ml無水甲醇和2ml正己烷，zui大速度渦旋振蕩5分鐘；
2）室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上層正己烷層，移取0.5ml下層清液到潔凈玻璃試管試管（避免觸碰脂肪層）；
3）在50-60℃下氮氣吹干或蒸干樣品；
4）加入400ul的1×復(fù)溶液和500ul正己烷，zui大速度渦旋振蕩1分鐘；
5）轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除上層正己烷層，移取50ul下層清液進(jìn)行分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.2ppb
5.3.3 尿液/血清/血漿處理方法
1）取0.5 ml 樣品，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
2）取50µl上清液，加入200µl 1×復(fù)溶液，混勻；
3）取50µl用于檢測。
    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.2ppb
（如果需要，可以加大1×復(fù)溶液的用量來加大稀釋倍數(shù)）
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，37℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。